Năm 1954, khi Ngô Đình Diệm về nước, nắm quyền Thủ tướng Quốc gia Việt Nam, Ngô Đình Nhu đã lập ra đảng Cần lao – Nhân vị để làm lực lượng chính trị hậu thuẫn. Trần Kim Tuyến đã gia nhập đảng Cần lao và trở thành người thân tín của Ngô Đình Nhu. Sau khi nền Đệ Nhất Cộng hòa Việt Nam được thành lập năm 1955, ông được giao chức vụ Giám đốc Sở Nghiên cứu Chính trị Xã hội trực thuộc Phủ Tổng thống, thường được gọi ngắn là Sở Nghiên cứu Chính trị và có tên gọi tắt là Phòng 4. Thực chất, đây là một trung tâm tình báo chiến lược, đặt dưới sự chỉ huy trực tiếp của Cố vấn chính trị Ngô Đình Nhu, với nhiệm vụ trấn áp các phe phái đối lập để bảo vệ chế độ, chỉ huy toàn bộ các nhóm tình báo, mật vụ, cảnh sát đặc biệt và phần nào kiểm soát các đơn vị đặc nhiệm chống đảo chính. Trần Kim Tuyến trở thành một trong những nhân vật có quyền lực cao nhất của nền Đệ Nhất Cộng hòa.

Sau cuộc đảo chính 11 tháng 11 năm 1960, tuy âm mưu thất bại, (Đoán mò không đúng sự thật là ông Trần Kim Tuyến thất sủng do bị quy trách nhiệm không dự báo trước được cuộc đảo chính. Do đó ông tỏ ra bất mãn và thiên về hướng đối lập)- Trong cuộc phỏng vấn của ông Lâm Lễ Trinh với ông Huỳnh văn Lang thì một số người làm việc cho Tuyến lạm dụng quyền hành trong việc thầu sổ số mà có liên hệ đến mẹ vợ của ông Huỳnh văn Lang, ông Lang vào gặp ông TT Diệm để trình bày ngọn nguồn, sau đó ông HVL mất chức. Năm 1961, Đoàn Công tác Đặc biệt Miền Trung và lực lượng cảnh sát đặc biệt được sáp nhập vào Tổng nha cảnh sát. Các đơn vị đặc nhiệm chống đảo chính được tổ chức thành Lữ đoàn liên binh phòng vệ Phủ Tổng thống và chịu sự điều động của Bộ Quốc phòng. Sở Nghiên cứu chính trị bị thu hẹp quyền lực. Trong thời gian này, Trần Kim Tuyến đã có những liên hệ với các nhóm đối lập và các nhóm tình báo nước ngoài, đặc biệt là cơ quan tình báo Anh.

Ngày 27 tháng 2 năm 1962, hai phi công Nguyễn Văn Cử và Phạm Phú Quốc ném bom dinh Độc Lập. Sở Nghiên cứu chính trị một lần nữa bị quy trách nhiệm về việc không dự báo được cuộc ném bom này và người chịu trách nhiệm chính là Giám đốc Trần Kim Tuyến. Sau đó không lâu, ông nhận được quyết định của Tổng thống Ngô Đình Diệm về việc giải thể Sở Nghiên cứu chính trị và cử ông làm Tổng lãnh sự Việt Nam Cộng Hòa tại Ai Cập vào đầu năm 1963. Tuy nhiên, trên đường quá cảnh tại Hongkong, Trần Kim Tuyến đã xin tị nạn chính trị và từ chức Tổng lãnh sự. Từ đó ông bắt đầu sống cuộc sống lưu vong lần thứ nhất.